2023年2月23日，北京年夜学程以及平、王爱平易近团队于 Nature Methods 于线揭晓题为 Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection 的文章（链接：https://doi.org/10.1038/s41592-023-01777-3）。文中报导了重量仅为2.17克的微型化三光子显微镜（图1），初次实现对于自由举动小鼠的年夜脑全皮层以及海马神经元功效成像，为展现年夜脑深部布局中的神经机制开启了新的研究范式。

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图1 小鼠佩带微型化三光子显微镜实景图

剖析脑毗连图谱以及功效动态图谱是我国以及世界多国脑规划的一个重点研究标的目的，为此需要制造自由运动植物佩带式显微成像类研究东西。2017年，北京年夜学程以及平院士团队乐����Ϸapp成研制第一代2.2克微型化双光子显微镜，获取了小鼠于自由举动历程中年夜脑皮层神经元以及神经突触勾当的动态图象。2021年，该团队的第二代微型化双光子显微镜将成像视线扩展了7.8倍，同时具有获取年夜脑皮层上千个神经元功效旌旗灯号的三维成像威力。

这次，北京年夜学最新的微型化三光子显微镜一举冲破了此前微型化多光子显微镜的成像深度极限：显微镜引发光路可以穿透整个小鼠年夜脑皮层以及胼胝体，实现对于小鼠海马CA1亚区的间接不雅测记载（图2），神经元钙旌旗灯号最年夜成像深度可达1.2 妹妹，血管成像深度可达1.4 妹妹。别的，于光毒性方面，全皮层钙旌旗灯号成像仅需要几个毫瓦，海马钙旌旗灯号成像仅需要20至50毫瓦，年夜年夜低在构造毁伤的保险阈值。是以，该款微型三光子显微镜可以永劫间不间断持续不雅测神经元功效勾当，而不孕育发生较着的光漂白与光毁伤。

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图2 微型三光子显微成像记载小鼠年夜脑皮层L1-L6以及海马CA1的布局以及功效动态。CC：胼胝体。绿色代表GCaMP6s标志的神经元荧光钙旌旗灯号，洋红色代表硬脑膜、微血管以及脑白质界面的三次谐波旌旗灯号。

海马体位在皮层以及胼胝体下面，于短时间影象到持久影象的巩固、空间影象以及情绪编码等方面起主要作用。于啮齿类植物研究模子中，海马间隔脑外貌深度年夜在一个毫米。因为年夜脑构造，出格是胼胝体，具备对于光的高散射光学特征，以是冲破成像深度极限是持久以来困扰神经科学家的一个极年夜的应战。此前的微型单光子及微型多光子显微镜均没法实现穿透全皮层间接对于海马区举行无损成像。

北京年夜学微型化三光子显微镜成像深度的冲破患上益在全新的光学构型设计（图3）。作者经由过程对于皮层、白质以及海马体成立分层散射模子举行仿真，发明荧光旌旗灯号从深层构造达到脑外貌时已经经处在随机散射的状况，使患上显微物镜荧光网络效率降低，从而极年夜限定了成像深度。针对于这一问题，经典阿贝聚光镜布局被引入构型设计中：微型阿贝聚光镜与简化的无穷远物镜密接可以提高散射光的通透效率；阿贝聚光镜与引发光路中的微型管镜部门复用，可以进一步简化布局，降低损耗。整体上，新微型化显微镜的散射荧光网络效率实现了成倍的晋升。

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图3 微型化三光子显微镜光学构型

同时，哄骗微型三光子显微镜，作者研究了小鼠顶叶皮层第六层神经元于抓取糖豆这一觉得运动历程中的编码机制：发明约莫37%的神经元于抓取动作以前就最先活跃且于抓取时最活跃，约莫5.6%的神经元于抓取动作以后最先活跃，申明差别神经元介入了差别阶段的编码（图4）。这一成果开端展示了微型化三光子显微镜于脑科学研究中的运用潜力。

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图4 小鼠顶叶皮层第六层神经元于抓取糖豆使命中的差别反映类型

北京年夜学将来技能学院玻士后赵春竹、北京年夜学前沿交织学科研究院玻士研究生陈诗源、北京年夜学份子医学南京转化研究院研究员张立风为该论文的配合第一作者，北京年夜学程以及平、王爱平易近、赵春竹为论文的配合通信作者。该工程获得科技立异2030- 脑科学与类脑研究 庞大工程、中国医学科学院医学与康健科技立异项目 脑疾病的线粒体机制研究立异单位、国度天然科学基金委、国度庞大科研仪器研制专项、科技部重点研发规划等经费撑持。

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